总生存期。然而，只有不到20%的患者对免疫检查点抑制剂单药治疗获益，且大

  体8）单抗与PD-1抑制剂联用后对非小细胞肺癌的疗效，为今后的临床应用提

  1.分别构建小鼠A549非小细胞肺癌肿瘤模型和NCI-H1299非小细胞肺癌

  PD-1耐药肿瘤模型。设立空白对照组、PD-1抑制剂给药组、VEGF抑制剂给药

  组及VEGF抑制剂联合PD-1抑制剂给药组，并记录小鼠体重和肿瘤体积以探究

  其样本肿瘤相关的免疫细胞的CCR8阳性表达，进行组织学评分。然后通过构建

  人源化小鼠非小细胞肺癌肿瘤模型。设立空白对照组、PD-1抑制剂给药组、CCR8

  单抗给药组及PD-1抑制剂联合CCR8单抗给药组，并记录小鼠体重和肿瘤体积

  1.两组非小细胞肺癌模型均显示VEGF抑制剂和PD-1抑制剂联用组显著减

  缓小鼠肿瘤体积的增长。免疫组化结果为，VEGF抑制剂与PD-1抑制剂联用

  中表达情况基本相同；在30-50岁的人群中的表达强度明显高于65岁以上的人

  群。在临床Ⅲ-Ⅳ期病人中，CCR8的表达量明显高于Ⅰ-Ⅱ期病人。动物模型结

  CD8T细胞数量增强抗肿瘤效果，并且对PD-1抑制剂耐药患者具有潜在的临床

  CCR8单抗联用PD-1抑制剂通过清除调节性T细胞，增加肿瘤免疫细胞的浸润

  有不足10%的癌症病人来自遗传缺陷，超过90%的癌症患者更多源于环境和生

  肺癌的80%，其主要亚型包括鳞状细胞癌、腺癌和大细胞癌。目前认为大量吸烟

  经处于Ⅲ-Ⅳ期，已经很少能有手术治疗的机会。只有靠药物医治。而目前化疗药

  手术切除是最有效的治疗方法，适用于I期至II期和特定的III期病例。90年代

  末，随着吉非替尼的问世，NSCLC患者开始使用分子靶向疗法。以顺铂为基础

  的双联疗法的辅助细胞毒治疗是晚期NSCLC患者的标准疗法，完全切除的II期

  法成为2013年的科学突破。靶向细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白-4（CytotoxicT

  断抑制剂标志着肺癌治疗的新方向。结合抗PD-(L)1和抗CTLA-4单克隆抗体可

  激活侵袭和转移，引发肿瘤促进炎症，避免免疫破坏，在不同程度上依赖于TME

  比正常细胞具有细胞毒性应激存活能力受损。化疗是小细胞肺癌、非小细胞肺癌、

  四十年的临床研究记录了化疗对肺癌患者的有效性。化疗药物能改善肺癌症状，

  向药物和生物制剂为一些患者提供了很好的治疗效果，但其他患者的反应并不好，

  1800年PaulRich首次提出的“魔力子弹”想法，它最初用来描述一种专门针对

  小分子靶向治疗已得到了广泛的普及，能够比较好地缓解病人的一些临床症状，

  而且能够有良好的预后，并相对延长生存期。血管内皮生长因子（Vascular

  管的形成）的关键媒介，能够与两种VEGF受体（VEGFR-1和VEGFR-2）特异

  性配对并结合。这两种VEGF受体表达在血管内皮细胞上。健康的人类在胚胎发

  育中VEGF可以在一定程度上促进血管生成，并能促进成年人身上的伤口愈合。VEGF是

  的血管，使其生长速度倍增。肿瘤在VEGF作用下形成不规则，迂回曲折，有死

  VEGF在肿瘤血管生产中的这种核心作用使其成为抗癌治疗的合理目标[13]

  [14]，为免疫治疗方法的发展奠定了基础。肿瘤免疫治疗是利用免疫调节刺激物来

  现免疫逃逸，促进肿瘤的恶性发展，其中肿瘤相关的巨噬细胞（Tumor-associated

  macrophage，TAM）和T-regs发挥最大的作用。肿瘤非免疫微环境由肿瘤内部成

  纤维细胞、血管内皮细胞基质细胞的浸润构成。肿瘤相关的成纤维细胞（Cancer-

  员的I型跨膜糖蛋白，结构上由288个氨基酸组成。PD-1最开始是应用消减杂

  细胞凋亡有关，因此又被称为程序性死亡蛋白-1。PD-1有很显著的结构特

  ITIM），在免疫应答进程中[17,18]，通过酪氨酸的磷酸化作用，发挥对原受体刺激

  信号的拮抗效应，在负性调控进程中发挥关键性功能。PD-1抑制通路在各种恶

  性肿瘤中的反应率为20%-50%，临床试验已经取得了惊人的成果。PD-L1

  巴细胞的肿瘤免疫效应，能抑制免疫反应。所以通过阻断这对相互作用的抗体，

  恢复自身免疫细胞对肿瘤的杀伤，是一种有效的抗肿瘤治疗方式。PD-L1作为

  PD-1/PD-L1阻断治疗的靶点，是目前唯一被FDA批准用于预测NSCLC患者抗

  PD-1/PD-L1单克隆抗体疗效的生物标志物，PD-L1高表达的患者更容易对抗PD-

  1/PD-L1单克隆抗体治疗产生反应并从中获益。影响PD-L1在肿瘤中表达的

  翻译和翻译后修饰等多个层面上调节PD-L1的表达[21,22]。在NSCLC中，EGFR、

  驱动基因突变也被报道与PD-L1表达有关。有必要注意一下的是，NSCLC的驱动基

  因突变也可以影响对抗PD-1/PD-L1单克隆抗体的反应。特别是LKB1突变对

  抗PD-1/PD-L1单克隆抗体的疗效的显著影响[25,26]，引起了学者们的关注，成为

  研发热门靶点。抗PD-1mAb已被美国食品药品监督管理局批准，能够适用于治疗

  晚期黑色素瘤、肺鳞癌以及非鳞状NSCLC。目前上市的PD-1/L1抗体可以在肾

  细胞癌Ⅰ期患者中应用，打破了传统的治疗模式，患者的整体生存期（Overall

  免疫系统对肿瘤细胞的杀伤，起到免疫抑制作用。肿瘤中T-reg数量特异性升高

  的T-reg或抑制其功能能够有效激起体内的抗肿瘤反应，唤起强劲的抗肿瘤免疫

  力，有效延长肿瘤患者的生存期。因此，通过靶向清除肿瘤微环境中T-reg已

  中，调节性T细胞的占比在肿瘤部位有所增加，与自然杀伤细胞（NaturalKiller

  效应性T细胞与T-regs之间的比例会降低，同时有研究者也发现肿瘤浸润

  1/PD-L1抑制剂的进展彻底改变了免疫肿瘤学领域。肿瘤药物研发的热门领域中

  移性黑色素瘤以及转移性非小细胞肺癌。并且也作为EGFR或ALK突变阴性的

  ProportionScore,TPS）评分高于或等于50%时，帕博利珠单抗已取代化疗药物

  A亚型结合。贝伐珠单抗通过与VEGF-A结合阻止VEGF-A与VEGFR的相互

  作用，从而抑制促进新生血管形成的VEGF信号通路的激活。体内研究表明，贝

  细胞成熟。所以由于其作用方式，贝伐珠单抗的临床研发集中在某些肿瘤类型上，

  增强。在结合抗PD-L1和抗VEGF疗法的临床试验中，已经观察到具有共同

  员之一，属于G蛋白偶联受体。CCR8和T-reg细胞介导的免疫抑制CCR8T-reg

  和CCL18。其中，小鼠CCR8配体CCL8是一种高亲和力趋化因子，在结构相似

  性和优越的功能效力方面与人CCL18不同。最近的体内研究显示CCR8在特应

  CCL1主要是T细胞产物，由组织吞噬细胞、肥大细胞和肿瘤细胞分泌。近期有

  报告在肿瘤微环境中CCL1通过CCR8发挥抗凋亡活性，在细胞凋亡耐药性成人

  T细胞白血病和小鼠T细胞淋巴瘤中体现特殊意义。CCL1刺激增殖并导致膀胱

  癌细胞的迁移。同时，由于CCL1趋化因子通过进入淋巴管的癌细胞上的CCR8

  会导致该肿瘤癌细胞中的CCR8表达增加。在人类和小鼠中，CCR8是唯一已知

  reg细胞浸润到肿瘤组织中，行使免疫抑制功能，同时能诱导FOXp3+T-reg细

  IL-10和颗粒酶B表达上调，进而增强这些肿瘤浸润的T-reg细胞的免疫抑制活

  性。诱导阻断活性的抗体能够大大减少肿瘤内的T-reg细胞积聚，驱动T细胞活化并

  FOXp3CCR8T-reg细胞以增强抗肿瘤免疫，并通过补体激活的经典途径固定补

  联合使用来改善抗肿瘤免疫应答。随着肿瘤驻留的T-regs的特异性地被消耗，

  可以产生有效的抗肿瘤免疫，同时外周稳态也得以维持。已有肿瘤相关的T-regs

  标记物CTLA4和CCR4药物上市。CCR8仅在人类肿瘤微环境的浸润性T-regs

  中显著上调，其不可能会引起系统性自身免疫。CCR8在肿瘤浸润的T-reg细胞上特

  异性表达，而在外周血T-reg或正常组织上基本不表达。这种在肿瘤微环境中的

  特异性表达使其具有更有效更安全的药理优势，因此CCR8单抗有望成为新一代

  的新模式。目前化疗被认为能大大的提升PD-1抑制剂免疫治疗的疗效，不过其具体

  [41]。联合治疗模式的病理反应效果明显优于单一治疗模式。除免疫治疗和化疗外，

  显，总体5年生存率约为40%[42]。然而免疫疗法和TKI抑制剂的出现，为肿瘤

  验结果已经证明了PD-L1+VEGF双靶点治疗的优势，可以显着降低死亡和疾病

  进展的风险以及提高生存率。抗PD-L1和抗VEGF组合的功效已在临床试验

  CCR8参与T-reg和Th2细胞向炎症和肿瘤部位的募集,其高表达与多种癌

  现CCR8在其中发挥着重要的作用。从免疫小鼠模型中发现CCR8+T-reg能

  驱动免疫抑制的发生，是一群真正具有免疫抑制功能的T-reg亚群。先前研究

  报道在小鼠体内，趋化因子受体CCR8主要表达于T-reg细胞；同时也见于表达

  Th1）上未见表达。人体内CCR8表达情况与小鼠类似，此外，人体内CCR8

  也见于表达在约2%的CD8阳性细胞表面。研究之后发现CCR8对于T-reg发挥功能

  至关重要，缺乏CCR8的T-reg无法预防致命性的移植物抗宿主病。因此CCR8

  是肿瘤浸润T-reg上表达的重要趋化因子受体，通过消耗表达CCR8靶点的T-reg

  可以减少T-reg的表达，从而增强自身免疫对肿瘤细胞的杀伤，以达到肿瘤治疗

  的效果。而CCR8作为T-reg的特异性靶点之一存在广泛的应用前景。针对CCR8

  肿瘤T-reg细胞表达高水平的CCR8，其在小鼠CCR8特异性抗体的单一疗

  要作用方式涉及ADCC，导致表达CCR8的肿瘤T-reg细胞被消除。抗CCR8

  与抗PD-1的协同作用可能会引起Ti-T-regs的扩张和肿瘤的过度进展，这种现象

  将被随之而来的Ti-T-regs消耗所抵消。联合疗法的肿瘤生长减少可归因于富含

  效应CD8+T细胞的免疫原性更强的TME。据报道，抑制性Ti-T-regs和效应CD8

  +T细胞之间的这种改变平衡对于有效的抗肿瘤免疫反应至关重要。抗PD-1治

  疗存在免疫相关不良事件（irAE）的概率，比如结肠炎、甲状腺功能低下、腹泻

  等。但抗PD-1和抗CCR8的组合治疗显着影响肿瘤生长，不会诱发肠道炎症。

  过去几十年里，针对PD-1/PD-L1免疫检查点封锁显著改善了晚期实体瘤患

  者的治疗效果。然而，只有不到20%的患者受益于检查点抑制剂药物，最终会产

  (OS)。临床前研究表明，在多次施用VEGF抑制剂后，由于PD-L1高表达，肿

  重要作用，PD-1/PD-L1抑制剂和VEGF抑制剂的联合治疗被认为具有更好的抗

  肿瘤作用。然而VEGF抑制剂与PD-1抑制剂联用的在肿瘤微环境中发生的作用

  清除T-reg慢慢的变成了当下肿瘤免疫治疗的热门方向。CCR8作为肿瘤浸润T-reg上

  的重要趋化因子受体之一，也对于T-reg发挥功能起着及其重要的作用。通过消耗表达

  CCR8靶点的T-reg能够大大减少T-reg的表达，从而增强自身免疫对肿瘤细胞的杀

  伤，以达到肿瘤治疗的效果。另外，研究指出使用CCR8单抗和PD-1特异性抗

  然而，CCR8+T-reg发挥抑制作用的内在机制及靶向阻断CCR8是否能在人体肿

  瘤重激活抗肿瘤免疫反应仍有待证实。此外，CCR8在中国人群肿瘤上的表达也

  没有涉及。文章旨在探索CCR8在中国人群中的表达特点，并寻找CCR8单抗与

  PD-1抑制剂联用在动物模型上应用的疗效，为国内药物的上市及应用提供参考。

  本课题构建了M-NSG小鼠的A549非小细胞肺癌和H1299非小细胞肺癌

  PD-1耐药肿瘤模型，设立空白对照组、PD-1抑制剂组和VEGF抑制剂组、以及

  PD-1抑制剂联合VEGF抑制剂组。通过记录小鼠体重和肿瘤体积，并定量评估

  肿瘤的坏死面积占比、血管生成量和成熟度、CD8T细胞数量等指标考察PD-1

  抑制剂和VEGF抑制剂联合给药对A549非小细胞肺癌和H1299非小细胞肺癌

  1.5.2.2CCR8在非小细胞肺癌表达和PD-1药物联用CCR8单抗疗效探究

  疫细胞有CCR8阳性表达，进行组织学评分。对CCR8阳性病例分析，考察比较

  剂组、CCR8单抗组、PD-1抑制剂联合CCR8单抗组。记录肿瘤体积及小鼠体

  重，进行免疫组化和细胞流式术，考察CCR8单抗联用PD-1抑制剂在动物模型

  抗PD-1抗体。帕博利珠单抗与PD-1的结合不接合Fc受体或激活补体，因此它

  没有任何细胞毒性活性。PD-1抑制剂及其配体PD-L1是EGFR或ALK突变阴

  贝伐珠单抗（Bevacizumab，药商品名：Avastin）是由罗氏制药研发的世界

  NSCLC患者中，与铂类化疗或EGFR酪氨酸激酶抑制剂厄洛替尼联合使用时，

  显示出改善的OS和/或PFS，具有可接受的毒性和耐受性。非临床研究表明，

  贝伐珠单抗抑制VEGF通过促进肿瘤脉管系统回到正常状态、增加肿瘤微环境中的T

  细胞浸润以及使免疫抑制细胞活性降低来提高PD-1/PD-L1抗体的治疗效果。因

  此，贝伐珠单抗可能会增强PD-1/PD-L1抗体的疗效，临床研究应调查联合治疗

  以阻断PD-1和PD-L1之间的相互作用并增强T细胞反应。可以捕获VEGF-

  活状态。此外，与联合治疗相比，抗VEGF和PD-L1偶联能够最终靠靶向肿瘤

  本章构建了M-NSG小鼠的A549非小细胞肺癌和H1299非小细胞肺癌PD-

  珠单抗联合贝伐珠单抗组。记录小鼠给药前后体重和肿瘤体积，考察PD-1抑制

  剂和VEGF抑制剂联合给药对非小细胞肺癌和PD-1抑制剂耐药的非小细胞肺癌

  雄性M-NSG小鼠，19-20周龄，均参照实验动物管理和使用委员会（IACUC）

  规定，所有实验动物经维通利华实验动物管理和使用委员会(IACUC)批准，

  RPMI-1640+10%FBS培养基传代培养细胞。用无血清培养基：基质胶=7：3制备

  细胞系和基因编辑：获得NCI-H1299细胞系和耐PD-1基因的RNA序列。

  设计并合成耐PD-1基因的CRISPR引导RNA或准备耐PD-1基因的表达载体。

  功能检测：使用免疫荧光染色、Westernblot或流式细胞术等手段，检测PD-

  肿瘤移植模型：使用MSG小鼠。准备PD-1阳性的NCI-H1299细胞，将PD-

  1阳性的NCI-H1299细胞注射到小鼠的皮下或体内，建立肿瘤移植模型。

  分别对接种A549和H1299细胞小鼠随机分组，给药和持续周期：当小鼠肿

  瘤体积达到100mm时，依据肿瘤数据对小鼠随机分组。Vehicle组给与生理盐

  水，PD-1组帕博利珠单抗给药，VEGF组贝伐珠单抗给药，联合用药组帕博利珠

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